該研究由北海道健康科學(xué)大學(xué)牙口腔生物學(xué)系的Takeharu Niioka團隊發(fā)表在《Archives of Oral Biology》期刊。研究聚焦大鼠咬肌，圍繞三個問題展開：（1）支配血管的副交感神經(jīng)是否具有血管活性腸肽（VIP）免疫反應(yīng)性；（2）靜脈注射VIP是否會誘發(fā)血管舒張；（3）在存在或不存在阿托品的情況下，選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP對副交感神經(jīng)血管舒張的影響。

摘要

已知副交感神經(jīng)血管舒張纖維通過膽堿能和非膽堿能兩種機制支配大鼠咬肌的血管，但非膽堿能機制尚不明確。近年來，血管活性腸肽（VIP）已被證實參與口腔頜面部（如下頜下腺和下唇）的副交感神經(jīng)血管舒張過程，然而關(guān)于大鼠咬肌的相關(guān)研究卻極為有限。本研究以大鼠咬肌為研究對象，旨在評估：（1）支配血管的副交感神經(jīng)是否具有VIP免疫反應(yīng)性；（2）靜脈注射VIP是否會誘發(fā)血管舒張；（3）在存在或不存在阿托品的情況下，選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP對副交感神經(jīng)血管舒張的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在副交感耳神經(jīng)節(jié)（OG）以及血管周圍的神經(jīng)纖維這兩個部位均檢測到VIP免疫反應(yīng)性。靜脈注射VIP可誘發(fā)血管舒張，而[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP能減弱VIP注射所引發(fā)的血管舒張效應(yīng)。單獨使用[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP無法抑制副交感神經(jīng)血管舒張，但當[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP與阿托品聯(lián)合使用時，可減弱副交感神經(jīng)血管舒張。這些結(jié)果表明：（1）支配咬肌血管的節(jié)后副交感神經(jīng)中存在VIP；（2）靜脈注射VIP可誘發(fā)咬肌血管舒張；（3）當毒蕈堿膽堿能受體被阿托品阻斷或乙酰膽堿（ACh）釋放受到抑制而失活時，VIP可能參與咬肌的副交感神經(jīng)血管舒張過程。

實驗材料與儀器

（一）實驗材料

1. 實驗動物：成年雄性Wistar大鼠；

2. 示蹤劑與試劑：2%熒光金、無菌生理鹽水、VIP、選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP、阿托品、烏拉坦、潘庫溴銨；

3. 抗體與染色相關(guān)試劑：VIP抗體、囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運體抗體、Alexa-488標記驢抗兔IgG抗體、Alexa-568標記驢抗山羊IgG抗體、熒光素標記蓖麻凝集素I、1%非免疫驢血清、0.3%曲拉通X-100、0.3%牛血清白蛋白、4%多聚甲醛、0.1M磷酸緩沖液、30%蔗糖；

（二）實驗儀器

4. Omegawave FLO-C1 激光多普勒血流儀、熒光顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡、冷凍切片機、Hamilton微量注射器、加熱墊、人工呼吸機、導(dǎo)管（用于股靜脈和股動脈插管）

Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀

實驗過程

1. 動物飼養(yǎng)與倫理審批

2. 熒光雙標記實驗

3. 免疫組化染色

4. 咬肌血流量測量：實驗前切斷雙側(cè)頸迷走神經(jīng)和頸上交感干，以排除迷走神經(jīng)和交感神經(jīng)的影響。通過電刺激左側(cè)舌神經(jīng)中樞切斷端誘發(fā)咬肌副交感神經(jīng)反射性血管舒張，用Omegawave FLO-C1 激光多普勒血流儀監(jiān)測并記錄咬肌血流量（MBF）變化。分別靜脈注射不同劑量VIP，觀察MBF變化；在注射100ng/kg VIP前20分鐘，持續(xù)輸注[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP，觀察其對VIP誘發(fā)MBF升高的影響。此外，分別在靜脈注射阿托品后、持續(xù)輸注[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP時、以及兩者聯(lián)合使用時，電刺激舌神經(jīng)，記錄MBF變化，結(jié)果以用藥前對照反應(yīng)的百分比表示。

Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀

（A） 舌神經(jīng)（LN）電刺激（對照）及靜脈注射血管活性腸肽（VIP，劑量分別為 1、10 和 100 ng/kg）誘發(fā)平均血流量（MBF） 增加的典型示例。

（B） 匯總了注射 0（僅生理鹽水）、1、10 和 100 ng/kg VIP 后誘發(fā)的 MBF 增加情況（n = 4）。數(shù)據(jù)以LN 電刺激誘發(fā)的對照反應(yīng)的百分比表示。

（C） （C） 在選擇性 VIP 受體拮抗劑（[4 - 氯 - D - 苯丙氨酸?, 亮氨酸 1?] 血管活性腸肽，[4Cl-D-Phe?, Leu1?] VIP） 存在與缺失時，注射 100 ng/kg VIP 誘發(fā) MBF 增加的典型示例。

（D） （D） [4Cl-D-Phe?, Leu1?] VIP 對 100 ng/kg VIP 注射所誘發(fā) MBF 增加的影響，以預(yù)處理反應(yīng)的百分比表示（n = 5）。

5. 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)論

1. 支配大鼠咬肌血管的節(jié)后副交感神經(jīng)中存在VIP免疫反應(yīng)性，且VIP與VAChT（膽堿能標志物）在耳神經(jīng)節(jié)的FG標記神經(jīng)元以及咬肌血管周圍的神經(jīng)纖維上存在共定位；

2. 靜脈注射VIP以劑量依賴性方式誘發(fā)大鼠咬肌血管舒張，且不影響全身動脈血壓，選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP可抑制VIP誘發(fā)的這種血管舒張效應(yīng)，表明VIP通過激活咬肌血管壁上的VIP受體發(fā)揮作用；

3. 單獨使用[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP對舌神經(jīng)刺激誘發(fā)的咬肌副交感神經(jīng)血管舒張無影響，單獨使用阿托品可部分減弱該血管舒張效應(yīng)；而當[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP與阿托品聯(lián)合使用時，可抑制該血管舒張效應(yīng)，提示當毒蕈堿受體被阿托品阻斷或乙酰膽堿釋放受到抑制時，VIP參與咬肌的副交感神經(jīng)血管舒張調(diào)節(jié)。