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伴隨著激光共聚焦掃描成像儀Amersham Typhoon™ 進入市場數(shù)十年，其在各方面的應(yīng)用也在不斷發(fā)展。我們搜集了用戶在使用Amersham Typhoon™進行的各方面研究成果，分享給大家。今天，我們先來介紹Amersham Typhoon™在染色質(zhì)DNA水平的調(diào)控中的應(yīng)用之染色質(zhì)復(fù)制。
在真核生物中，目前有關(guān)DNA復(fù)制的相關(guān)機制研究比較深入，然而對染色質(zhì)的復(fù)制和表觀遺傳信息傳遞的分子機理尚待深入的研究。DNA的復(fù)制往往伴隨著染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的組裝，因而子鏈上核小體的組裝和DNA合成是緊密耦聯(lián)，這一過程可以稱之為DNA復(fù)制耦聯(lián)的核小體組裝（DNA replication–coupled nucleosome assembly），對維持基因組的完整性具有重要作用。盡管此前許多研究發(fā)現(xiàn)了一些組蛋白分子伴侶參與核小體組裝，但是這一過程是如何耦聯(lián)到DNA復(fù)制上的這一具體分子機制仍然不清楚。
2017年在Science上發(fā)表的” RPA binds histone H3-H4 and functions in DNA replication–coupled nucleosome assembly”一文，報道了一個能夠結(jié)合單鏈DNA的重要復(fù)制蛋白A（RPA,replication protein A）復(fù)合體在DNA復(fù)制耦聯(lián)的核小體組裝中的重要作用，對闡釋DNA復(fù)制耦聯(lián)的核小體組裝具有重要意義。
該研究首先通過co-IP分析得出RPA蛋白與組蛋白H3-H4在S期能形成RPA-H3-H4復(fù)合物。為了研究 該復(fù)合物對形成DNA-組蛋白復(fù)合物的影響，該研究設(shè)計了模擬新解旋復(fù)制叉的ss-dsDNA和對照dsDNA，使用EMSA實驗進行分析。結(jié)果表明：H3-H4與ss-dsDNA和dsDNA（H3-H4形成了二聚體和四聚體，dsDNA-(H3-H4)復(fù)合物出現(xiàn)兩條帶）均能結(jié)合（藍色箭頭）。發(fā)現(xiàn)PRA與ss-dsDNA能夠形成RPA-DNA復(fù)合物（綠色箭頭），而與dsDNA結(jié)合能力很弱，表明RPA結(jié)合在ss-dsDNA中的單鏈部分。隨著RPA濃度的增加，形成的RPA-DNA-(H3-H4)復(fù)合物增多（紅色箭頭），表明RPA促進DNA與H3-H4的結(jié)合；而在dsDNA中，則無此作用。

進一步，為了確定H3-H4組裝到ssDNA還是dsDNA上，結(jié)合EMSA加入了HhaI酶切。結(jié)果表明，當H3-H4結(jié)合后，對ss-dsDNA形成了保護作用，使其不能被切斷（藍色箭頭），從而確認H3-H4組裝位置在雙鏈DNA上。

結(jié)合其他實驗，該研究發(fā)現(xiàn)：RPA能夠直接結(jié)合沒有修飾的H3-H4組蛋白復(fù)合體，促進ssDNA-(H3-H4)復(fù)合體的形成，并能迅速的將H3-H4連接到相鄰的dsDNA上，同時招募一系列組蛋白分子伴侶（CAF-1、FACT和Rtt106）協(xié)助新的核小體的組裝。

這一研究表明，RPA在新生染色質(zhì)上的核小體組裝中起到重要作用，其通過協(xié)調(diào)多個組蛋白伴侶，將組蛋白摻入到復(fù)制叉上，為DNA復(fù)制偶聯(lián)的核小體組裝提供了一個很好的“平臺”。