早期AAV(Adeno-associated virus,簡(jiǎn)稱(chēng)AAV — 腺相關(guān)病毒)產(chǎn)品的病毒載體培養(yǎng)方式多采用貼壁培養(yǎng)。但隨著工藝的提升，懸浮培養(yǎng)能更好地滿足生產(chǎn)工藝的放大升級(jí)，故此，由貼壁培養(yǎng)轉(zhuǎn)向懸浮培養(yǎng)的293T細(xì)胞系成為了新型趨勢(shì)。
本文分享一則新型HEK293細(xì)胞AAV包裝工藝研究實(shí)例，主要基于樂(lè)純生物L(fēng)ePhinix®EZG 臺(tái)式生物反應(yīng)器中Pro款型號(hào)，即：LePhinix®EZG Pro 臺(tái)式生物反應(yīng)器，通過(guò)自研的TinnBio自控軟件實(shí)現(xiàn)對(duì)搭載玻璃罐的精準(zhǔn)控制，實(shí)現(xiàn)AAV高表達(dá)滴度、高體積培養(yǎng)。
設(shè)備與工藝
培養(yǎng)參數(shù)
本研究采用樂(lè)純生物集團(tuán)旗下康晟生物自主研發(fā)的Wayne293®瞬轉(zhuǎn)培養(yǎng)基，培養(yǎng)懸浮細(xì)胞Wayne® LVPro HEK293。
LePhinix®EZG Pro 臺(tái)式生物反應(yīng)器參數(shù)設(shè)置如下表1所示，接種前，需對(duì)玻璃罐進(jìn)行保壓測(cè)試及滅菌梳理，再加入Wayne293®瞬轉(zhuǎn)培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)參數(shù)參考表2。
表1.LePhinix®EZG Pro 臺(tái)式生物反應(yīng)器配置參數(shù)
表2.玻璃罐參數(shù)設(shè)置
培養(yǎng)小Tips
懸浮培養(yǎng)過(guò)程中，AAV轉(zhuǎn)染需注意：
接種密度、轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度、轉(zhuǎn)染時(shí)間；轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基；質(zhì)粒比例、質(zhì)粒總量、PEI與質(zhì)粒比例；轉(zhuǎn)染后收貨時(shí)間等因素，這些變量因素是決定AAV產(chǎn)量高低的關(guān)鍵。
培養(yǎng)工藝
搖瓶階段：
①種子復(fù)蘇后，每隔 48h 按照 0.5M 傳代；
?、诜N子輕微聚團(tuán)，可適當(dāng)提高搖床轉(zhuǎn)速或者采用帶檔板搖瓶培養(yǎng)；
③一般建議細(xì)胞濃度達(dá)到2.5M~3.0M，且活率>95%進(jìn)行轉(zhuǎn)染；
轉(zhuǎn)染階段：
?、俎D(zhuǎn)染前檢測(cè)細(xì)胞懸液中 Glc&Gln 含量，需調(diào)整懸液 Glc≥6g/L 和 Gln≥4mM；
?、谵D(zhuǎn)染試劑配置時(shí)，推薦質(zhì)粒：PEI=1：3，且現(xiàn)配現(xiàn)用；
上罐階段：
?、傧冉尤虢K體積 80% 培養(yǎng)基，設(shè)置參數(shù)，空罐預(yù)培養(yǎng) 4h 以上；
?、诎凑?0.5M 接種進(jìn)行操作；
?、勖刻鞜o(wú)菌取樣計(jì)數(shù)，待細(xì)胞濃度達(dá)到2.5M~3.0M，且活率>95%進(jìn)行轉(zhuǎn)染；
?、苻D(zhuǎn)染后每隔 24h 取樣計(jì)數(shù)，流式或熒光拍照得出轉(zhuǎn)染效率，留樣 QPCR 等；
?、菀话戕D(zhuǎn)染 72h 左右實(shí)驗(yàn)室測(cè)得GFP(目的基因)轉(zhuǎn)染效率最高，最后進(jìn)行 QPCR 病毒滴度測(cè)試；
⑥準(zhǔn)備下罐或繼續(xù)培養(yǎng)，收集數(shù)據(jù)。
注：優(yōu)化工藝階段，可通過(guò)不同時(shí)間段留樣對(duì)比目的基因的轉(zhuǎn)染效率與滴度值波動(dòng)的相關(guān)性，選取最優(yōu)工藝，進(jìn)行后續(xù)生產(chǎn)。
數(shù)據(jù)分析
表3.1L(200rpm)某批次培養(yǎng)數(shù)據(jù)
注：day05 72h 測(cè) QPCR 為 8.41E+11copies/ml。
圖1.轉(zhuǎn)染24h熒光照片
圖2.轉(zhuǎn)染48h熒光照片
圖3.轉(zhuǎn)染72h熒光照片
表4.1L(220rpm)某批次培養(yǎng)數(shù)據(jù)
圖4.轉(zhuǎn)染24h熒光照片
圖5.轉(zhuǎn)染48h熒光照片
圖6.轉(zhuǎn)染72h熒光照片
表5.5L(80rpm)某批次培養(yǎng)數(shù)據(jù)
注：day05 72h 測(cè) QPCR 為 1.18E+12copies/ml。
圖8 轉(zhuǎn)染24h熒光照片
圖9 轉(zhuǎn)染48h熒光照片
圖10 轉(zhuǎn)染72h熒光照片
結(jié)論
通過(guò)以上幾批玻璃罐內(nèi)包裝 AVV 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，轉(zhuǎn)染第三天 AVV 滴度穩(wěn)定表達(dá) 8~9E+11copies/ml，其中 5L 培養(yǎng)體積最高達(dá)到 1.18E+12copies/ml。
對(duì)比臺(tái)式反應(yīng)器控制 200rpm 和 220rpm 批間差異不大，細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程一致，數(shù)據(jù)具有高度重合性，說(shuō)明臺(tái)式反應(yīng)器控制精準(zhǔn)，各部件協(xié)作調(diào)控功能穩(wěn)定。
綜上，LePhinix®EZG PRO臺(tái)式反應(yīng)器可實(shí)現(xiàn)溫度，pH，溶氧等關(guān)鍵工藝參數(shù)的精準(zhǔn)控制，搭配Wayne293® 瞬轉(zhuǎn)培養(yǎng)基，可更好的實(shí)現(xiàn)293細(xì)胞AAV包裝工藝優(yōu)化，提升293細(xì)胞的生長(zhǎng)效果和達(dá)到更高的病毒產(chǎn)量。
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LePhinix®EZG 臺(tái)式生物反應(yīng)器
全譜系家族
三種款式，滿足多種功能選擇
掃描二維碼獲取產(chǎn)品資料
更可申領(lǐng)樣機(jī)體驗(yàn)
樂(lè)純生物集團(tuán)
產(chǎn)品專(zhuān)員
關(guān)于Wayne293® 瞬轉(zhuǎn)培養(yǎng)基
Wayne293® 瞬轉(zhuǎn)培養(yǎng)基是一款針對(duì)人類(lèi)胚胎腎細(xì)胞 293 (HEK293) 和其衍生細(xì)胞系所研發(fā)的無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物成分培養(yǎng)基，適用于 HEK293 系列細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、化學(xué)轉(zhuǎn)染及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，具有高密度增殖、高效率轉(zhuǎn)染和高產(chǎn)量表達(dá)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。
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