非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒（恒溫熒光法）使用說明書

【產品說明】

本產品基于的恒溫熒光檢測技術，可針對抗凝血、脾臟、扁桃體、淋巴結、腎臟和骨髓等樣品中非洲豬瘟病毒的的特異核酸片段進行擴增，儀器實時監(jiān)測擴增過程中的熒光信號變化，自動判讀結果。

本產品用于非洲豬瘟病毒的檢測，檢出限為10² copies/μl。

【貨 號】 YRMBV7201-2

【包裝規(guī)格】 50T

【試劑盒組成】

【儲存條件及有效期】

-20℃保存，有效期為12個月（請在有效期內使用）。

【適用儀器】

YR-820 恒溫擴增熒光檢測儀。

【樣品采集及存放】

待測樣品為 -20℃保存樣本或新鮮待檢樣本

【樣品處理】

可采集發(fā)病動物或同群動物的血清學樣品和病原學樣品，病原學樣品主要包括抗凝血、脾臟、扁桃體、淋巴結、腎臟和骨髓等。如環(huán)境中存在鈍緣軟蜱，也應一并采集。

樣品的包裝和運輸應符合《高致病性動物病原微生物菌（毒）種或者樣本運輸包裝規(guī)范》規(guī)定。規(guī)范填寫采樣登記表，采集的樣品應在冷藏和密封狀態(tài)下運輸到相關實驗室。

一、血清學樣品：無菌采集5ml血液樣品，室溫放置12～24h，收集血清，冷藏運輸。到達檢測實驗室后，冷凍保存。

二、病原學樣品

1．抗凝血樣品：無菌采集5ml抗凝血，冷藏運輸。到達檢測實驗室后，－70℃冷凍保存。

2．組織樣品

2.1 脾臟，其次為扁桃體、淋巴結、腎臟、骨髓等，冷藏運輸。

2.2 樣品到達檢測實驗室后，－70℃保存。

3．鈍緣軟蜱

3.1 將收集的鈍緣軟蜱放入有螺旋蓋的樣品瓶/管中，放入少量土壤，蓋內襯以紗布，常溫保存運輸。

3.2 到達檢測實驗室后，－70℃冷凍保存或置于液氮中；如僅對樣品進行形態(tài)學觀察時，可以放入99%酒精中保存。

【檢測步驟】

自備材料和儀器：①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②滅菌0.2mL PCR管或八聯管；③冰盒；④移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；⑤離心機；⑥渦旋混勻器；⑦金屬浴

一、DNA提取（樣本制備區(qū)）

建議使用病毒基因組DNA提取試劑盒系列產品，具體過程詳見說明書。

二、試劑配制（試劑準備區(qū)，放置于冰盒中進行）

若有N個待檢樣品，則參照下表，按照N+2個數量計算各組分用量（N個待檢樣品+1個陰性對照NG+1個陽性對照PG），將反應液置于0.6ml或者1.5ml離心管中，渦旋混勻，離心30秒，分裝于0.2ml PCR管中，并向每管加入1滴C-I（約20μl）。

三、添加模板（模板添加區(qū)，放置于冰盒中進行）

向PCR管中分別加入2μl模板，順序為陰性對照（陰性對照管可不加入模板）、待測樣品模板、PG-ASFV-I，離心30秒，立即進行擴增反應。

四、擴增反應（擴增及產物分析區(qū)）

(一)、恒溫儀器63℃條件下反應30 min。待儀器升溫至63℃后，新建程序，設置實驗名稱及反應時間，將步驟三中離心后的PCR反應管放入恒溫擴增熒光檢測儀，點擊開始檢測。

(二)、若使用熒光定量PCR儀，則熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇None，將63℃ 15 s，63℃ 45 s作為一個循環(huán)，于63℃ 45 s處收集熒光信號，30個循環(huán)。

其他儀器請參照儀器說明書進行設置。

【結果判定】

1、 儀器自動判定結果，若顯示“陽性”，則樣品中含有非洲豬瘟病毒；

若顯示“陰性”，則樣品中不含有非洲豬瘟病毒或含量低于檢測限。

2、 在檢測儀上，根據有無“S”型擴增曲線判定結果。

若有“S”型擴增曲線，則樣品中含有非洲豬瘟病毒；

若無“S”型擴增曲線，則樣品中不含有非洲豬瘟病毒或含量低于檢測限。

« 陰性對照反應管結果顯示“陰性”，陽性對照反應管結果顯示“陽性”，此次檢測結果有效，否則無效。如重復檢測結果仍為無效，請與技術支持人員聯系。

【注意事項】

1、本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區(qū)操作。

1）一區(qū)：試劑準備區(qū)；2）第二區(qū)：樣本制備區(qū)；第三區(qū)：模板添加區(qū)；第四區(qū)：擴增及產物分析區(qū)。

★ 分區(qū)之間*進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2、實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區(qū)域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。

3、嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。

4、反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應液以適當體積分管保存。

5、反應結束后，擴增管請置于密封袋內丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。

6、不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內使用。

原創(chuàng)作者：廈門科朋儀器有限公司